In der molekularen Biologie ist DNA ligase ein spezifischer Typ des Enzyms, eines ligase, , der einzeln gestrandete Diskontinuitäten in doppelten gestrandeten DNA-Molekülen in einfachen Wortufern repariert, die Brechung des doppelten Ufers (ein Einbruch beider Ergänzungsufer der DNA) haben. Gereinigte DNA ligase wird im Genklonen verwendet, um sich DNA-Molekülen zusammen anzuschließen. Die Alternative, eine Brechung des einzelnen Ufers, wird durch einen verschiedenen Typ der DNA ligase das Verwenden des Ergänzungsufers als eine Schablone befestigt, aber verlangt noch, dass DNA ligase das phosphodiester Endband schafft, um die DNA völlig zu reparieren.

DNA ligase hat Anwendungen sowohl in der DNA-Reparatur als auch in DNA-Erwiderung (sieh Säugetierligases). Außerdem hat DNA ligase umfassenden Nutzen in molekularen Biologie-Laboratorien für Genetische Wiederkombinationsexperimente (sieh Anwendungen in der molekularen Biologie-Forschung).

Mechanismus von Ligase

Der Mechanismus der DNA ligase ist, zwei covalent phosphodiester Obligationen zwischen 3' hydroxyl Enden eines nucleotide, ("Annehmers") mit dem 5' Phosphatende von anderem ("Spender") zu bilden. ATP ist für die ligase Reaktion erforderlich, die in drei Schritten weitergeht: (1) wird adenylation (Hinzufügung des AMPERES) eines Rückstands im aktiven Zentrum des Enzyms, pyrophosphate veröffentlicht; (2) Übertragung des AMPERES zum 5' Phosphat des so genannten Spenders, der Bildung eines pyrophosphate Bandes; (3) Bildung eines phosphodiester Bandes zwischen dem 5' Phosphat des Spenders und den 3' hydroxyl des Annehmers.

Ligase wird auch mit stumpfen Enden arbeiten, obwohl höhere Enzym-Konzentrationen und verschiedene Reaktionsbedingungen erforderlich sind.

Säugetierligases

In Säugetieren gibt es vier spezifische Typen von ligase.

• DNA ligase I: Ligates die werdende DNA des langsam vergehenden Ufers nach dem Ribonuclease H hat die RNS-Zündvorrichtung von den Bruchstücken von Okazaki entfernt.
• DNA ligase II: wechselweise gesplissene Form der DNA ligase III gefunden in sich nichtteilenden Zellen.
• DNA ligase III: Komplexe mit der DNA reparieren Protein XRCC1, um in der auf Robbenjagd gehenden DNA während des Prozesses der nucleotide Ausschneidungsreparatur und recombinant Bruchstücke zu helfen.
• DNA ligase IV: Komplexe mit XRCC4. Es katalysiert den Endschritt am nichthomologen Ende, sich DNA-Brechungsreparatur-Pfad des doppelten Ufers anschließend. Es ist auch für V (D) J Wiederkombination, der Prozess erforderlich, der Ungleichheit in immunoglobulin und geometrischen T-Zellempfänger-Orten während der Immunsystem-Entwicklung erzeugt.

DNA ligase in E. coli verwendet gewonnene Energie durch das Kleben von Nicotinamide-Adenin dinucleotide (NAD), um das phosphodiester Band zu schaffen. DNA ligase von eukaryotes und einigen anderen Mikroben verwendet Adenosin triphosphate (ATP) aber nicht NAD. Außerdem ist mehrere andere Struktur-Gegenwart in der DNA ligase das AMPERE und lysine, von denen beide im Ligation-Prozess wichtig sind, da sie ein Zwischenenzym schaffen.

Anwendungen in der molekularen Biologie-Forschung

DNA ligases ist ein unentbehrliches Werkzeug in der modernen molekularen Biologie-Forschung geworden, um recombinant DNA-Folgen zu erzeugen. Zum Beispiel wird DNA ligases mit Beschränkungsenzymen verwendet, um DNA-Bruchstücke, häufig Gene in plasmids einzufügen.

Ein Lebensaspekt zum Durchführen effizienter Wiederkombinationsexperimente, die mit dem ligation von zusammenhaltend beendeten Bruchstücken verbunden sind, kontrolliert die optimale Temperatur. Die meisten Experimente verwenden T4 DNA Ligase (isoliert von bacteriophage T4), der an 25°C am aktivsten ist. Jedoch, für die optimale ligation Leistungsfähigkeit mit zusammenhaltend beendeten Bruchstücken ("klebrige Enden"), muss die optimale Enzym-Temperatur mit der schmelzenden Temperatur T (auch die Ausglühen-Temperatur) der klebrigen Enden erwogen werden, ligated seiend. Wenn die Umgebungstemperatur T überschreitet, würde die homologe Paarung der klebrigen Enden nicht stabil sein, weil die hohe Temperatur das Wasserstoffabbinden stört. Reaktion von Ligation ist am effizientesten, wenn die klebrigen Enden bereits stabil ausgeglüht werden, würde die Störung der Ausglühen-Enden deshalb, auf niedrige ligation Leistungsfähigkeit hinauslaufen. Je kürzer das Überhängen, desto tiefer der T normalerweise ein 4-Basen-überhängt, einen T von 12-16°C hat.

Da stumpf beendete DNA-Bruchstücke keine zusammenhaltenden Enden haben, um auszuglühen, ist die schmelzende Temperatur nicht ein Faktor, um innerhalb der normalen Temperaturreihe der ligation Reaktion in Betracht zu ziehen. Jedoch, je höher die Temperatur, desto weniger zufällig, dass die anzuschließenden Enden ausgerichtet werden, um ligation zu erlauben (bewegen Moleküle die Lösung mehr bei höheren Temperaturen). Der Begrenzungsfaktor am stumpfen Ende ligation ist nicht die Tätigkeit des ligase, aber eher der Zahl von Anordnungen zwischen DNA-Bruchstück-Enden, die vorkommen. Die effizienteste ligation Temperatur für die stumpf beendete DNA würde deshalb die Temperatur sein, bei der die größte Zahl von Anordnungen vorkommen kann. Deshalb, die Mehrheit von stumpf beendetem ligations werden am 14-20°C über Nacht ausgeführt. Die Abwesenheit bedeuten stabil ausgeglühte Enden auch, dass die ligation Leistungsfähigkeit gesenkt wird, eine höhere ligase Konzentration verlangend, verwendet zu werden. (T4 DNA ligase ist die einzige gewerblich verfügbare DNA ligase, um stumpfe Enden auszuglühen).

Geschichte

Die erste DNA ligase wurde gereinigt und 1967 charakterisiert. Die allgemeine gewerblich verfügbare DNA ligases wurde in bacteriophage T4, E. coli und andere Bakterien ursprünglich entdeckt.

Siehe auch

• DNA-Ende
• Verkleidung des Ufers
• DNA-Erwiderung
• Bruchstück von Okazaki
• DNA Polymerase

Links

• DNA Ligase: PDB Molekül des Monats
• Universität von Davidson allgemeine Information über Ligase
• DNA von OpenWetWare Ligation Protokoll