Hochleistungsflüssigchromatographie (manchmal gekennzeichnet als Hochdruckflüssigchromatographie), HPLC, ist eine chromatographic Technik, die verwendet ist, um eine Mischung von Zusammensetzungen in der analytischen Chemie und Biochemie mit dem Zweck zu trennen, sich zu identifizieren, messend und die individuellen Bestandteile der Mischung reinigend. Einige allgemeine Beispiele sind die Trennung und quantitation von Leistungserhöhungsrauschgiften (z.B Steroiden) in Urinproben, oder Niveaus des Vitamins D im Serum.

HPLC verwertet normalerweise verschiedene Typen von stationären Phasen (d. h. sorbents) enthalten in Säulen, eine Pumpe, die die bewegliche Phase und Beispielbestandteile durch die Säule und einen Entdecker bewegt, der dazu fähig ist, charakteristische Aufbewahrungsfristen für die Beispielbestandteile und Bereichszählungen zur Verfügung zu stellen, die den Betrag jedes analyte das Durchführen des Entdeckers widerspiegeln. Der Entdecker kann auch mit dem analyte verbundene Zusatzinformation zur Verfügung stellen, (d. h. UV/Vis spektroskopische Daten, wenn so ausgestattet). Aufbewahrungsfrist von Analyte ändert sich abhängig von der Kraft seiner Wechselwirkungen mit der stationären Phase, der Zusammensetzung und dem Durchfluss der beweglichen Phase verwendet, und auf den Säulendimensionen. HPLC ist eine Form der Flüssigchromatographie, die kleine Größe-Säulen verwertet (normalerweise 250 Mm oder kürzer und 4.6 Mm i.d. oder kleiner; gepackt mit kleineren Partikeln) und höherem beweglichem Phase-Druck im Vergleich zur gewöhnlichen Flüssigchromatographie.

Mit HPLC stellt eine Pumpe (aber nicht Ernst) den höheren Druck zur Verfügung, der erforderlich ist, die bewegliche Phase und Beispielbestandteile durch die dicht gepackte Säule zu bewegen. Die vergrößerte Dichte entsteht aus dem Gebrauch von kleineren sorbent Partikeln. Solche Partikeln sind dazu fähig, bessere Trennung auf Säulen der kürzeren Länge wenn im Vergleich zur gewöhnlichen Säulenchromatographie zur Verfügung zu stellen.

Operation

Die Probe, die zu trennen und zu analysieren ist, wird in einem getrennten kleinen Volumen in den Strom der beweglichen Phase eingeführt, die durch die Säule durchsickert. Die Bestandteile der Beispielbewegung durch die Säule an verschiedenen Geschwindigkeiten, die Funktionen von spezifischen physischen oder chemischen Wechselwirkungen mit der stationären Phase sind. Die Geschwindigkeit jedes Bestandteils hängt von seiner chemischen Natur, auf der Natur der stationären Phase (Säule) und auf der Zusammensetzung der beweglichen Phase ab. Die Zeit, in der ein spezifischer analyte elutes (erscheint aus der Säule), die Aufbewahrungsfrist genannt wird. Die unter besonderen Bedingungen gemessene Aufbewahrungsfrist wird als eine sich identifizierende Eigenschaft eines gegebenen analyte betrachtet. Der Gebrauch von kleineren Partikel-Größe-Verpackungsmaterialien verlangt den Gebrauch des höheren betrieblichen Drucks ("backpressure"), und verbessert normalerweise chromatographic Entschlossenheit (d. h. der Grad der Trennung zwischen aufeinander folgendem analytes, der aus der Säule erscheint). Allgemeine bewegliche verwendete Phasen schließen jede mischbare Kombination von Wasser mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln ein (die allgemeinsten sind Acetonitril und Methanol). Einige HPLC Techniken verwenden bewegliche freie Wasserphasen (sieh Normale Phase HPLC unten). Der wässrige Bestandteil der beweglichen Phase kann Puffer, Säuren (wie formic, phosphorige oder trifluoroacetic Säure) oder Salze enthalten, um bei der Trennung der Beispielbestandteile zu helfen. Die Zusammensetzung der beweglichen Phase kann unveränderlich ("isocratic elution Weise") behalten oder ("Gradientenentwicklungsweise") während der chromatographic Analyse geändert werden. Isocratic elution ist in der Trennung von Beispielbestandteilen normalerweise wirksam, die in ihrer Sympathie für die stationäre Phase nicht sehr unterschiedlich sind.

In der Gradientenentwicklung wird die Zusammensetzung der beweglichen Phase normalerweise von niedrig bis hohe eluting Kraft geändert. Die eluting Kraft der beweglichen Phase wird durch analyte Aufbewahrungsfristen mit der hohen eluting Kraft widerspiegelt, die schnellen elution (=short Aufbewahrungsfristen) erzeugt. Ein typisches Anstieg-Profil in der umgekehrten Phase-Chromatographie könnte an 5-%-Acetonitril (im wässrigen oder Wasserpuffer) anfangen und geradlinig zu 95-%-Acetonitril mehr als 5-25 Minuten fortschreiten. Die Periode der unveränderlichen beweglichen Phase-Zusammensetzung kann ein Teil jedes gradeint Profils sein. Zum Beispiel kann die bewegliche Phase-Zusammensetzung unveränderlich an 5-%-Acetonitril seit 1-3 Minuten behalten werden, die von einem geradlinigen Änderungsacetonitril von bis zu 95 % gefolgt sind.

Die Zusammensetzung der beweglichen Phase hängt von der Intensität von Wechselwirkungen zwischen analytes und stationärer Phase (z.B hydrophobe Wechselwirkungen in umgekehrtem phasigem HPLC) ab. Abhängig von ihrer Sympathie für die stationären und beweglichen Phasen analytes Teilung zwischen den zwei während des Trennungsprozesses, der in der Säule stattfindet. Dieser Verteilen-Prozess ist dem ähnlich, das während einer flüssig-flüssigen Förderung vorkommt, aber dauernd, nicht schrittweise ist. In diesem Beispiel, mit einem Anstieg des Wassers/Acetonitrils, werden mehr hydrophobe Bestandteile elute (die Säule abzugehen), spät, sobald die bewegliche Phase konzentrierter in Acetonitril (d. h. in einer beweglichen Phase höher eluting Kraft) wird.

Die Wahl von beweglichen Phase-Bestandteilen, Zusätze (wie Salze oder Säuren) und Anstieg-Bedingungen hängt von der Natur der Säule und Beispielbestandteile ab. Häufig wird eine Reihe von Probeläufen mit der Probe durchgeführt, um die HPLC Methode zu finden, die die beste Trennung gibt.

Typen

Verteilungschromatografie

Verteilungschromatografie war die erste Art der Chromatographie das Chemiker haben sich entwickelt. Der mitwirkende Teilungsgrundsatz ist in Papierchromatographie, dünner Schicht-Chromatographie, Gasphase und flüssig-flüssigen Anwendungen angewandt worden. Der 1952-Nobelpreis in der Chemie wurde von Archer John Porter Martin und Richard Laurence Millington Synge für ihre Entwicklung der Technik verdient, die für ihre Trennung von Aminosäuren verwendet wurde. Verteilungschromatografie verwendet ein behaltenes Lösungsmittel, auf der Oberfläche oder innerhalb der Körner oder Fasern einer "trägen" festen Unterstützen-Matrix als mit der Papierchromatographie; oder nutzt einen coulombic und/oder Wasserstoffspender-Wechselwirkung mit der festen Unterstützung aus. Moleküle equilibrate (Teilung) zwischen einer flüssigen stationären Phase und dem Eluenten. Bekannt als Wasserquellfähige Wechselwirkungschromatographie (HILIC) in HPLC trennt diese Methode auf polaren Unterschieden gestützten analytes. HILIC verwendet meistenteils eine verpfändete polare stationäre Phase und organische hohe, mischbare Wasserkonzentration, bewegliche Phasen. Teilung HPLC ist historisch auf der unverpfändeten Kieselerde oder den Tonerde-Unterstützungen verwendet worden. Jeder arbeitet effektiv, um analytes durch polare Verhältnisunterschiede zu trennen. Verpfändete Phasen von HILIC sind im Vorteil, acidic, grundlegenden und neutralen solutes in einem einzelnen Chromatogramm zu trennen.

Die polaren analytes verbreiten sich in eine stationäre Wasserschicht, die mit der polaren stationären Phase vereinigt ist, und werden so behalten. Retentionskraft-Zunahme mit der vergrößerten analyte Widersprüchlichkeit und die Wechselwirkung zwischen dem polaren analyte und der polaren stationären Phase (hinsichtlich der beweglichen Phase) vergrößern die elution Zeit. Die Wechselwirkungskraft hängt von den funktionellen Gruppen im analyte Molekül ab, die das Verteilen fördern, aber auch coulombic (elektrostatische) Wechselwirkung und Wasserstoffspender-Fähigkeit einschließen können. Der Gebrauch von mehr polaren Lösungsmitteln in der beweglichen Phase wird die Aufbewahrungsfrist des analytes vermindern, wohingegen mehr hydrophobe Lösungsmittel dazu neigen, Aufbewahrungsfristen zu vergrößern.

Normal-phasige Chromatographie

Es war eine der ersten Arten von HPLC das Chemiker haben sich entwickelt. Auch bekannt als normal-phasiger HPLC (NP-HPLC) oder Adsorptionschromatographie, diese Methode trennt analytes, der auf ihrer Sympathie für eine polare stationäre Oberfläche wie Kieselerde gestützt ist, folglich basiert es auf der analyte Fähigkeit, sich mit polaren Wechselwirkungen (wie Wasserstoffabbinden oder Dipoldipol-Typ von Wechselwirkungen) mit der Sorbent-Oberfläche zu beschäftigen. NP-HPLC verwendet eine nichtpolare, nichtwässrige bewegliche Phase, und arbeitet effektiv, um in nichtpolaren Lösungsmitteln sogleich auflösbaren analytes zu trennen. Der analyte verkehrt damit und wird durch die polare stationäre Phase behalten. Adsorptionskräfte nehmen mit der vergrößerten analyte Widersprüchlichkeit zu. Die Wechselwirkungskraft hängt nicht nur von der funktionellen Gruppengegenwart in der Struktur des analyte Moleküls, sondern auch auf steric Faktoren ab. Das Betreffen der steric Hindernis auf der Wechselwirkungskraft erlaubt dieser Methode sich aufzulösen (trennen) strukturellen isomers.

Der Gebrauch von mehr polaren Lösungsmitteln in der beweglichen Phase wird die Aufbewahrungsfrist von analytes vermindern, wohingegen mehr hydrophobe Lösungsmittel dazu neigen, langsamer elution (vergrößerte Aufbewahrungsfristen) zu veranlassen. Sehr polare Lösungsmittel wie Spuren von Wasser in der beweglichen Phase neigen dazu, zur festen Oberfläche der stationären Phase zu adsorbieren, die eine stationäre bestimmte (wasser)-Schicht bildet, die, wie man betrachtet, eine aktive Rolle in der Retention spielt. Dieses Verhalten ist der normalen Phase chromatograhy etwas eigenartig, weil es fast exklusiv durch einen adsorptive Mechanismus geregelt wird (d. h. analytes mit einer festen Oberfläche aber nicht mit der solvated Schicht eines der Sorbent-Oberfläche beigefügten ligand aufeinander wirken; sieh auch umgekehrten phasigen HPLC unten). Adsorptionschromatographie wird noch für isomer Strukturtrennungen sowohl in der Säule als auch in den Chromatographie-Formaten der dünnen Schicht auf der aktivierten (ausgetrockneten) Kieselerde oder den Tonerde-Unterstützungen weit verwendet.

Teilung - und NP-HPLC ist aus Bevorzugung in den 1970er Jahren mit der Entwicklung von umgekehrtem phasigem HPLC wegen der schlechten Reproduzierbarkeit von Aufbewahrungsfristen wegen der Anwesenheit eines Wassers oder Pro-Ticks organische lösende Schicht auf der Oberfläche der Kieselerde oder Tonerde chromatographic Medien gefallen. Diese Schicht ändert mit irgendwelchen Änderungen in der Zusammensetzung der beweglichen Phase (z.B Feuchtigkeitsniveau) das Verursachen von treibenden Aufbewahrungsfristen.

Kürzlich ist Verteilungschromatografie populär wieder bei der Entwicklung von verpfändeten Phasen von HILIC geworden, die verbesserte Reproduzierbarkeit, und wegen eines besseren Verstehens der Reihe der Nützlichkeit der Technik demonstrieren.

Versetzungschromatographie

Das Kernprinzip der Versetzungschromatographie ist:

Ein Molekül mit einer hohen Sympathie für die Chromatographie-Matrix (der displacer) wird sich effektiv um verbindliche Seiten bewerben, und so alle Moleküle mit kleineren Sympathien versetzen.

Es gibt verschiedene Unterschiede zwischen Versetzung und elution Chromatographie. In der elution Weise erscheinen Substanzen normalerweise aus einer Säule im schmalen, Spitzen von Gaussian. Die breite Trennung von Spitzen, vorzugsweise zur Grundlinie, wird gewünscht, um maximale Reinigung zu erreichen. Die Geschwindigkeit, mit der jeder Bestandteil einer Mischung unten die Säule in der elution Weise reist, hängt von vielen Faktoren ab. Aber für zwei Substanzen, um mit verschiedenen Geschwindigkeiten zu reisen, und dadurch aufgelöst zu werden, muss es wesentliche Unterschiede in etwas Wechselwirkung zwischen dem biomolecules und der Chromatographie-Matrix geben. Betriebsrahmen werden angepasst, um die Wirkung dieses Unterschieds zu maximieren. In vielen Fällen kann die Grundlinie-Trennung der Spitzen nur mit der Gradientenentwicklung und niedrigen Säule loadings erreicht werden. So sind zwei Nachteile zur elution Weise-Chromatographie, besonders an der Vorbereitungsskala, betriebliche Kompliziertheit, wegen des Anstieg-Lösungsmittel-Pumpens und niedrigen Durchflusses, wegen der niedrigen Säule loadings. Versetzungschromatographie ist im Vorteil gegenüber der elution Chromatographie, in der Bestandteile in Konsekutivzonen von reinen Substanzen aber nicht "Spitzen" aufgelöst werden. Weil der Prozess die Nichtlinearität der Isothermen ausnutzt, kann ein größeres Säulenfutter auf einer gegebenen Säule mit den gereinigten bei bedeutsam höheren Konzentrationen wieder erlangten Bestandteilen getrennt werden.

Umgekehrte phasige Chromatographie (RPC)

Umgekehrte Phase HPLC (RP-HPLC) hat eine nichtpolare stationäre Phase und eine wässrige, gemäßigt polare bewegliche Phase. Eine allgemeine stationäre Phase ist eine Kieselerde, die mit RMeSiCl oberflächenmodifiziert worden ist, wo R eine gerade Kette alkyl Gruppe wie CH oder CH ist. Mit solchen stationären Phasen ist Aufbewahrungsfrist für Moleküle länger, die, während polare Moleküle elute mehr sogleich (früh in der Analyse) weniger polar sind. Ein Ermittlungsbeamter kann Aufbewahrungsfristen vergrößern, indem er mehr Wasser zur beweglichen Phase hinzufügt; dadurch die Sympathie des hydrophoben analyte für die hydrophobe stationäre hinsichtlich der jetzt mehr wasserquellfähigen beweglichen Phase stärkere Phase machend. Ähnlich kann ein Ermittlungsbeamter Aufbewahrungsfrist vermindern, indem er mehr organisches Lösungsmittel zum Eluenten hinzufügt. RP-HPLC wird so allgemein verwendet, dass er häufig falsch "HPLC" ohne weitere Spezifizierung genannt wird. Die pharmazeutische Industrie verwendet regelmäßig RP-HPLC, um Rauschgifte vor ihrer Ausgabe zu qualifizieren.

RP-HPLC funktioniert auf dem Grundsatz von hydrophoben Wechselwirkungen, die aus der hohen Symmetrie in der zweipoligen Wasserstruktur entstehen und die wichtigste Rolle in allen Prozessen in der Lebenswissenschaft spielen. RP-HPLC erlaubt das Maß dieser interaktiven Kräfte. Die Schwergängigkeit des analyte zur stationären Phase ist zur Kontakt-Fläche um das nichtpolare Segment des analyte Moleküls auf die Vereinigung mit dem ligand auf der stationären Phase proportional. Diese solvophobic Wirkung wird durch die Kraft von Wasser für "die Höhle-Verminderung" um den analyte und die C-Kette gegen den Komplex von beiden beherrscht. Die in diesem Prozess veröffentlichte Energie ist zur Oberflächenspannung des Eluenten proportional (Wasser: 7.3 J/cm ², Methanol: 2.2 J/cm ²) und zur hydrophoben Oberfläche des analyte und des ligand beziehungsweise. Die Retention kann durch das Hinzufügen eines weniger polaren Lösungsmittels (Methanol, Acetonitril) in die bewegliche Phase vermindert werden, um die Oberflächenspannung von Wasser zu reduzieren. Gradientenentwicklung verwendet diese Wirkung durch das automatische Reduzieren der Widersprüchlichkeit und der Oberflächenspannung der wässrigen beweglichen Phase während des Kurses der Analyse.

Struktureigenschaften des analyte Moleküls spielen eine wichtige Rolle in seinen Retentionseigenschaften. Im Allgemeinen wird ein analyte mit einer größeren hydrophoben Fläche (C-H, C-C und allgemein nichtpolare Atomobligationen, wie S-S und andere) länger behalten, weil es mit der Wasserstruktur aufeinander nichtwirkt. Andererseits, analytes mit der höheren polaren Fläche (zugeteilt durch die Anwesenheit polarer Gruppen, solcher als - OH,-NH, GURREN oder-NH in ihrer Struktur) werden weniger behalten, weil sie in Wasser besser integriert werden. Solche Wechselwirkungen sind zu steric Effekten unterworfen, in denen sehr große Moleküle nur Zugang zu den Poren der stationären Phase beschränkt haben können, wo die Wechselwirkungen mit der Oberfläche ligands (alkyl Ketten) stattfinden. Solche Oberflächenhindernis läuft normalerweise auf weniger Retention hinaus.

Aufbewahrungsfrist nimmt mit der hydrophoben (nichtpolaren) Fläche zu. Verzweigte Kette setzt elute schneller zusammen als ihr entsprechender geradliniger isomers, weil die gesamte Fläche vermindert wird. Ähnlich organische Zusammensetzungen mit einzelnem C-C-bonds elute später als diejenigen mit einem C=C oder C-C-triple Band, weil das doppelte oder dreifache Band kürzer ist als ein einzelner C-C-bond.

Beiseite von der beweglichen Phase-Oberflächenspannung (organisatorische Kraft in der Eluent-Struktur) können andere bewegliche Phase-Modifikatoren analyte Retention betreffen. Zum Beispiel verursacht die Hinzufügung anorganischer Salze eine gemäßigte geradlinige Zunahme in der Oberflächenspannung von wässrigen Lösungen (ca. 1.5 J/cm ² pro Mol für NaCl, 2.5 J/cm ² pro Mol für (NH) SO), und weil das Wärmegewicht der analyte-lösenden Schnittstelle von der Oberflächenspannung, der Hinzufügung von Salzen kontrolliert wird, neigen dazu, die Aufbewahrungsfrist zu vergrößern. Diese Technik wird für die milde Trennung und die Wiederherstellung von Proteinen und den Schutz ihrer biologischen Tätigkeit in der Protein-Analyse (hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, HIC) verwendet.

Ein anderer wichtiger Faktor ist der bewegliche Phase-pH, da es den hydrophoben Charakter des analyte ändern kann. Aus diesem Grund verwenden die meisten Methoden ein Pufferungsreagenz wie Natriumsphosphat, um den pH zu kontrollieren. Puffer dienen vielfachen Zwecken: Kontrolle des pH, erklären Sie die Anklage auf der Kieselerde-Oberfläche der stationären Phase und Tat als Ion-Paarungsagenten für neutral, um Analyte-Anklage für neutral zu erklären. Ammonium formate wird in der Massenspektrometrie allgemein hinzugefügt, um Entdeckung von bestimmtem analytes durch die Bildung von Analyte-Ammonium-Zusätzen zu verbessern. Eine flüchtige organische Säure wie essigsaure Säure, oder meistens Ameisensäure, wird häufig zur beweglichen Phase hinzugefügt, wenn Massenspektrometrie verwendet wird, um den Säulenausfluss zu analysieren. Säure von Trifluoroacetic wird selten in Massenspektrometrie-Anwendungen wegen seiner Fortsetzung beim Entdecker und lösenden Liefersystem verwendet, aber kann in der sich verbessernden Retention von analytes wie Carboxylic-Säuren in Anwendungen wirksam sein, die andere Entdecker verwerten, weil es eine ziemlich starke organische Säure ist. Die Effekten von Säuren und Puffern ändern sich durch die Anwendung, aber verbessern allgemein chromatographic Entschlossenheit.

Umgekehrte Phase-Säulen sind ziemlich schwierig, im Vergleich zu normalen Kieselerde-Säulen zu beschädigen; jedoch bestehen viele umgekehrte Phase-Säulen aus alkyl derivatized Kieselerde-Partikeln und sollten mit wässrigen Basen nie verwendet werden, weil diese die zu Grunde liegende Kieselerde-Partikel zerstören werden. Sie können mit wässriger Säure verwendet werden, aber die Säule sollte zur Säure für den zu langen nicht ausgestellt werden, weil es die Metallteile der HPLC Ausrüstung zerfressen kann. RP-HPLC Säulen sollten mit dem sauberen Lösungsmittel nach dem Gebrauch gespült, um restliche Säuren oder Puffer zu entfernen, und in einer passenden Zusammensetzung des Lösungsmittels versorgt werden. Der Metallinhalt von HPLC Säulen muss niedrig behalten werden, wenn die bestmögliche Fähigkeit, Substanzen zu trennen, behalten werden soll. Ein guter Test auf den Metallinhalt einer Säule soll eine Probe einspritzen, die eine Mischung von 2,2 '- und 4,4 '-bipyridine ist. Weil die 2,2 '-bipy chelate das Metall können, wird die Gestalt der Spitze für die 2,2 '-bipy (verfolgt) verdreht, wenn Metallionen auf der Oberfläche der Kieselerde da sind...

Chromatographie des Größe-Ausschlusses

Chromatographie des Größe-Ausschlusses (SEC), auch bekannt als Gel-Durchdringungschromatographie oder Gel-Filtrieren-Chromatographie, trennt Partikeln auf der Grundlage von der Größe. Es ist allgemein eine niedrige Entschlossenheitschromatographie, und so wird es häufig für den endgültigen, "glänzend werdenden" Schritt einer Reinigung vorbestellt. Es ist auch nützlich, für die tertiäre Struktur und Vierergruppe-Struktur von gereinigten Proteinen zu bestimmen. SEC wird in erster Linie für die Analyse von großen Molekülen wie Proteine oder Polymer verwendet. SEC arbeitet durch das Abfangen dieser kleineren Moleküle in den Poren einer Partikel. Die größeren Moleküle gehen einfach an den Poren vorbei, weil sie zu groß sind, um in die Poren einzugehen. Größere Moleküle fließen deshalb durch die Säule, die schneller ist als kleinere Moleküle, d. h. je, kleiner das Molekül, desto länger die Aufbewahrungsfrist.

Diese Technik wird für den Molekulargewicht-Entschluss vom Polysaccharid weit verwendet. SEC ist die offizielle Technik (angedeutet durch das europäische Arzneimittelbuch) für den Molekulargewicht-Vergleich des verschiedenen gewerblich verfügbaren niedrigen Molekulargewichtes heparins.

Mit dem Ionaustauschchromatographie

In der mit dem Ionaustauschchromatographie (IC) basiert Retention auf der Anziehungskraft zwischen solute Ionen und beladenen zur stationären Phase gebundenen Seiten. Ionen derselben Anklage werden ausgeschlossen. Typen von Ion-Ex-Wechslern schließen ein:

• Polystyrol-Harze - Diese erlauben böse Verbindung, die die Stabilität der Kette vergrößert. Höhere böse Verbindung reduziert das Ausbrechen, das die Äquilibrierungszeit vergrößert und schließlich Selektivität verbessert.
• Zellulose und dextran Ion-Ex-Wechsler (Gele) - Diese besitzen größere Porengrößen und beladen niedrig Dichten, die sie passend für die Protein-Trennung machen.
• Kontrollierte Pore poröse oder Glaskieselerde

Im Allgemeinen bevorzugen Ion-Ex-Wechsler die Schwergängigkeit von Ionen der höheren Anklage und des kleineren Radius.

Eine Zunahme im Gegenion (in Bezug auf die funktionellen Gruppen in Harzen) Konzentration reduziert die Aufbewahrungsfrist. Eine Abnahme im pH reduziert die Aufbewahrungsfrist im Cation-Austausch, während eine Zunahme im pH die Aufbewahrungsfrist im Anion-Austausch reduziert. Durch das Senken des pH des Lösungsmittels in einer Cation-Austauschsäule, zum Beispiel, sind mehr Wasserstoffionen verfügbar, um sich um Positionen auf der anionic stationären Phase zu bewerben, dadurch eluting hat schwach cations gebunden.

Diese Form der Chromatographie wird in den folgenden Anwendungen weit verwendet: Wasserreinigung, Vorkonzentration von Spur-Bestandteilen, tauscht Chromatographie, mit dem Ionaustauschchromatographie von Proteinen, Chromatographie des Anion-Austausches des hohen pH von Kohlenhydraten und oligosaccharides und anderen ligand-aus.

Chromatographie von Bioaffinity

Dieser Chromatographic-Prozess verlässt sich auf das Eigentum biologisch aktiver Substanzen, stabile, spezifische und umkehrbare Komplexe zu bilden. Die Bildung dieser Komplexe ist mit der Teilnahme von allgemeinen molekularen Kräften wie die Wechselwirkung von Van der Waals, elektrostatische Wechselwirkung, Dipoldipol-Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung und das Wasserstoffband verbunden. Ein effizienter, biospecific Band wird durch eine gleichzeitige und gemeinsame Handlung von mehreren dieser Kräfte in den verbindlichen Ergänzungsseiten gebildet.

Wässrige normal-phasige Chromatographie

Wässrige normal-phasige Chromatographie (ANP) ist eine chromatographic Technik, die das bewegliche Phase-Gebiet zwischen umgekehrter phasiger Chromatographie (RP) und organischer normaler Phase-Chromatographie (ONP) umfasst. Diese Technik wird verwendet, um einzigartige Selektivität für wasserquellfähige Zusammensetzungen zu erreichen, normale Phase elution das Verwenden rückphasiger Lösungsmittel zeigend.

Fluss von Isocratic und Gradientenentwicklung

Eine Trennung, in der die bewegliche Phase-Zusammensetzung unveränderlich überall im Verfahren bleibt, wird isocratic (Bedeutung unveränderlicher Zusammensetzung) genannt. Das Wort wurde von Csaba Horvath ins Leben gerufen, der einer der Pioniere von HPLC war.

Die bewegliche Phase-Zusammensetzung muss unveränderlich nicht bleiben. Eine Trennung, in der die bewegliche Phase-Zusammensetzung während des Trennungsprozesses geändert wird, wird als eine Gradientenentwicklung beschrieben. Ein Beispiel ist ein Anstieg, der an 10-%-Methanol anfängt und an 90-%-Methanol nach 20 Minuten endet. Die zwei Bestandteile der beweglichen Phase werden normalerweise "A" und "B" genannt; A ist das "schwache" Lösungsmittel, das den solute elute nur langsam erlaubt, während B das "starke" Lösungsmittel der schnell elutes der solutes aus der Säule ist. In der rückphasigen Chromatographie ist Lösungsmittel A häufig Wasser oder ein wässriger Puffer, während B ein organisches Lösungsmittel ist, das mit Wasser, wie Acetonitril, Methanol, THF oder isopropanol mischbar ist.

In isocratic elution nimmt Maximalbreite mit der Aufbewahrungsfrist geradlinig gemäß der Gleichung für N, die Zahl von theoretischen Tellern zu. Das führt zum Nachteil, dass späte-eluting Spitzen sehr flach und breit werden. Ihre Gestalt und Breite können sie davon abhalten, als Spitzen anerkannt zu werden.

Gradientenentwicklung vermindert die Retention der späteren-eluting Bestandteile, so dass sie elute schneller, schmaler (und höher) gebend, für die meisten Bestandteile kulminieren. Das verbessert auch die Maximalgestalt für geschwänzte Spitzen, weil die zunehmende Konzentration des organischen Eluenten den zurückbleibenden Teil einer Spitze vorwärts stößt. Das vergrößert auch die Maximalhöhe (die Spitze sieht "schärfer" aus), der in der Spur-Analyse wichtig ist. Das Anstieg-Programm kann plötzliche "Schritt"-Zunahmen im Prozentsatz des organischen Bestandteils oder verschiedenen Hang zu verschiedenen Zeiten - alle gemäß dem Wunsch nach der optimalen Trennung in der minimalen Zeit einschließen.

In isocratic elution ändert sich die Selektivität wenn die Säulendimensionen (Länge und inneres Diameter) Änderung - d. h. die Spitzen elute in derselben Ordnung nicht. In der Gradientenentwicklung kann sich die Elution-Ordnung als die Dimensionen oder Durchfluss-Änderung ändern.

Die treibende Kraft in der umgekehrten Phase-Chromatographie entsteht in der hohen Ordnung der Wasserstruktur. Die Rolle des organischen Bestandteils der beweglichen Phase soll diese hohe Ordnung reduzieren und so die Verzögern-Kraft des wässrigen Bestandteils reduzieren.

Rahmen

Inneres Diameter

Das innere Diameter (ID) einer HPLC Säule ist ein wichtiger Parameter, der die Entdeckungsempfindlichkeit und Trennungsselektivität in der Gradientenentwicklung beeinflusst. Es bestimmt auch die Menge von analyte, der auf die Säule geladen werden kann. Größere Säulen werden gewöhnlich in Industrieanwendungen wie die Reinigung eines Rauschgift-Produktes für den späteren Gebrauch gesehen. Säulen des niedrigen Personalausweises haben Empfindlichkeit verbessert und senken lösenden Verbrauch auf Kosten der ladenden Kapazität.

• Größere ID-Säulen (mehr als 10 Mm) werden verwendet, um verwendbare Beträge des Materials wegen ihrer großen ladenden Kapazität zu reinigen.
• Analytische Skala-Säulen (4.6 Mm) sind der allgemeinste Typ von Säulen gewesen, obwohl kleinere Säulen an der Beliebtheit schnell gewinnen. Sie werden in der traditionellen quantitativen Analyse von Proben verwendet und verwenden häufig einen UV-Kraft-Absorptionsvermögen-Entdecker.
• Säulen der schmalen langweiligen Angelegenheit (1-2 Mm) werden für Anwendungen verwendet, wenn mehr Empfindlichkeit entweder mit speziellen UV-Kraft-Entdeckern, Fluoreszenz-Entdeckung oder mit anderen Entdeckungsmethoden wie mit der Flüssigchromatographiemassenspektrometrie gewünscht wird
• Kapillare Säulen (weniger als 0.3 Mm) werden fast exklusiv mit alternativen Entdeckungsmitteln wie Massenspektrometrie verwendet. Sie werden gewöhnlich von verschmolzenen Kieselerde-Haargefäßen, aber nicht den Röhren des rostfreien Stahls gemacht, die größere Säulen verwenden.

Partikel-Größe

Traditionellster HPLC wird mit der stationären Phase durchgeführt, die der Außenseite von kleinen kugelförmigen Kieselerde-Partikeln (sehr kleine Perlen) beigefügt ist. Diese Partikeln kommen in einer Vielfalt von Größen mit 5-M-Perlen, die das allgemeinste sind. Kleinere Partikeln stellen allgemein mehr Fläche und bessere Trennungen, aber den Druck zur Verfügung, der für optimale geradlinige Geschwindigkeitszunahmen durch das Gegenteil des quadratisch gemachten Partikel-Diameters erforderlich ist.

Das bedeutet, dass das Ändern zu Partikeln, die halb so groß sind, die Größe der Säule dasselbe haltend, die Leistung verdoppeln, aber den erforderlichen Druck durch einen Faktor vier vergrößern wird. Größere Partikeln werden in vorbereitendem HPLC (Säulendiameter 5 Cm bis zu> 30 Cm) und für non-HPLC Anwendungen wie Festphasenextraktion verwendet.

Porengröße

Viele stationäre Phasen sind porös, um größere Fläche zur Verfügung zu stellen. Kleine Poren stellen größere Fläche zur Verfügung, während größere Porengröße bessere Kinetik besonders für größeren analytes hat. Zum Beispiel könnte ein Protein, das nur ein bisschen kleiner ist als eine Pore, in die Pore eingehen, aber reist einmal innen nicht leicht ab.

Pumpe-Druck

Pumpen ändern sich in der Druck-Kapazität, aber ihre Leistung wird auf ihrer Fähigkeit gemessen, einen konsequenten und reproduzierbaren Durchfluss nachzugeben. Druck kann nicht weniger als 40 MPa (6000 lbf/in) oder ungefähr 400 Atmosphären erreichen. Moderne HPLC Systeme sind verbessert worden, um am viel höheren Druck zu arbeiten, und sind deshalb im Stande, viel kleinere Partikel-Größen in den Säulen (m) zu verwenden. Diese "Extremen Hohen Leistung Flüssigchromatographie" Systeme oder RSLC/UHPLCs können an bis zu 100 MPa (15,000 lbf/in ²), oder ungefähr 1000 Atmosphären arbeiten. Der Begriff "UPLC" ist eine Handelsmarke von Waters Corporation, aber wird manchmal gebraucht, um sich auf die allgemeinere Technik zu beziehen.

Siehe auch

• Csaba Horváth
• Ion-Chromatographie
• Säulenchromatographie

Weiterführende Literatur

• L. R. Snyder, J.J. Kirkland, und J. W. Dolan, Einführung in die Moderne Flüssigchromatographie, John Wiley & Sons, New York, 2009.
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• L. R. Snyder, J.J. Kirkland, und J. L. Glajch, Praktische HPLC Methode-Entwicklung, John Wiley & Sons, New York, 1997.
• S. Ahuja und H. T. Rasmussen (Hrsg.), HPLC Methode-Entwicklung für Arzneimittel, Akademische Presse, 2007.
• S. Ahuja und M.W. Dong (Hrsg.), Handbuch der Pharmazeutischen Analyse durch HPLC, Elsevier/Academic Presse, 2005.
• Y. V. Kazakevich und R. LoBrutto (Hrsg.). HPLC für Pharmazeutische Wissenschaftler, Wiley, 2007.
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Links