DNA-Impfung ist eine Technik, für einen Organismus gegen Krankheit durch das Einspritzen davon mit der genetisch konstruierten DNA zu schützen, um eine immunologische Antwort zu erzeugen. Nukleinsäure-Impfstoffe sind noch experimentell, und sind auf mehrere und parasitische Virenbakterienmodelle der Krankheit, sowie zu mehreren Tumor-Modellen angewandt worden. DNA-Impfstoffe haben mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Impfstoffen einschließlich der Fähigkeit, eine breitere Reihe von geschützten Ansprechtypen zu veranlassen.

Viele glauben, dass Impfstoffe unter den größten Ergebnissen der modernen Medizin - in Industrienationen sind, haben sie natürlich vorkommende Fälle der Pocken beseitigt, und fast Kinderlähmung beseitigt, während andere Krankheiten, wie Fleckfieber, rotavirus, Leberentzündung A und B und andere gut kontrolliert werden. Herkömmliche Impfstoffe bedecken jedoch nur eine kleine Zahl von Krankheiten, und Infektionen, die an wirksamen Impfstoffen Mangel haben, töten Millionen von Leuten jedes Jahr, mit AIDS, Leberentzündung C und Sumpffieber, das besonders üblich ist.

Die ersten Generationsimpfstoffe sind Impfstoffe des ganzen Organismus - entweder lebende und geschwächte oder getötete Formen. Lebende, verdünnte Impfstoffe, wie Pocken und Kinderlähmungsimpfstoffe, sind im Stande, MörderT-Zelle (T oder CTL) Antworten, Helfer-T-Zelle (T) Antworten und Antikörper-Immunität zu veranlassen. Jedoch gibt es eine kleine Gefahr, die Formen eines pathogen verdünnt hat, kann zu einer gefährlichen Form zurückkehren, und kann noch im Stande sein, Krankheit in immunocompromised Impfempfängern (wie diejenigen mit AIDS) zu verursachen. Während getötete Impfstoffe diese Gefahr nicht haben, können sie nicht spezifische Zellantworten des Mörders T erzeugen, und können überhaupt für einige Krankheiten nicht arbeiten. Um diese Gefahren zu minimieren, wurden die so genannten zweiten Generationsimpfstoffe entwickelt. Das sind Subeinheitsimpfstoffe, aus definierten Protein-Antigenen (wie Wundstarrkrampf oder Diphtherie toxoid) oder recombinant Protein-Bestandteile (wie die Leberentzündung B Oberflächenantigen) bestehend. Diese sind auch im Stande, T und Antikörper-Antworten, aber nicht Zellantworten des Mörders T zu erzeugen.

DNA-Impfstoffe sind die dritten Generationsimpfstoffe, und werden aus einem kleinen, kreisförmigen Stück der Bakterien-DNA zusammengesetzt (hat einen plasmid genannt), der genetisch konstruiert worden ist, um ein oder zwei spezifische Proteine (Antigene) von einem pathogen zu erzeugen. Die Impf-DNA wird in die Zellen des Körpers eingespritzt, wo die "innere Maschinerie" der Gastgeber-Zellen die DNA "liest" und sie verwendet, um die Proteine des pathogen zu synthetisieren. Weil diese Proteine als ausländisch erkannt werden, wenn sie durch die Gastgeber-Zellen bearbeitet und auf ihrer Oberfläche gezeigt werden, wird das Immunsystem alarmiert, der dann eine Reihe von geschützten Antworten auslöst. Diese DNA-Impfstoffe haben sich von "erfolglosen" Gentherapie-Experimenten entwickelt. Die erste Demonstration einer plasmid-veranlassten geschützten Antwort bestand darin, als Mäuse mit einem plasmid eingeimpft haben, hat das Ausdrücken des menschlichen Wachstumshormons Antikörper entlockt, anstatt Wachstum zu verändern.

Aktueller Gebrauch

So weit haben wenige experimentelle Proben eine Antwort herbeigerufen, die stark genug ist, um gegen Krankheit und die Nützlichkeit der Technik zu schützen, durch das Quälen, in menschlichen Proben abschließend bewiesen werden muss. Jedoch im Juni 2006 wurden positive Ergebnisse für einen Vogel-Grippe-DNA-Impfstoff bekannt gegeben, und ein Tier-DNA-Impfstoff, um Pferde vor Westvirus von Nil zu schützen, ist genehmigt worden. Im August 2007 wurde eine einleitende Studie in der DNA-Impfung gegen multiple Sklerose berichtet als, wirksam zu sein.

Vorteile und Nachteile von DNA-Impfstoffen

Vektoren von Plasmid für den Gebrauch in der Impfung

Vektor-Design

DNA-Impfstoffe entlocken die beste geschützte Antwort, wenn hoch aktive Ausdruck-Vektoren verwendet werden. Das sind plasmids, die gewöhnlich aus einem starken Virenbefürworter bestehen, um in der vivo Abschrift und Übersetzung des Gens (oder Ergänzungs-DNA) von Interesse zu fahren. Intron A kann manchmal eingeschlossen werden, um mRNA Stabilität zu verbessern und folglich Protein-Ausdruck zu vergrößern. Plasmids schließen auch ein starkes polyadenylation/transcriptional Beendigungssignal, wie Rinderwachstumshormon oder Kaninchen-Beta-globulin polyadenylation Folgen ein. Vektoren von Multicistronic werden manchmal gebaut, um mehr als einen immunogen auszudrücken, oder einen immunogen und ein immunostimulatory Protein auszudrücken.

Weil der plasmid das "Fahrzeug" ist, von dem der immunogen ausgedrückt wird, ist das Optimieren des Vektor-Designs für den maximalen Protein-Ausdruck notwendig. Eine Weise, Protein-Ausdruck zu erhöhen, ist durch die Optimierung des codon Gebrauchs von pathogenem mRNAs für eukaryotic Zellen. Pathogens haben häufig verschieden am INHALT als die Arten, die so immunisieren werden, die Genfolge des immunogen verändernd, um zu widerspiegeln, dass der in den Zielarten allgemeiner verwendete codons seinen Ausdruck verbessern kann.

Eine andere Rücksicht ist die Wahl des Befürworters. Der SV40 Befürworter wurde herkömmlich verwendet, bis Forschung gezeigt hat, dass vom Befürworter von Rous Sarcoma Virus (RSV) gesteuerte Vektoren viel höhere Ausdruck-Raten hatten. Mehr kürzlich sind Ausdruck-Raten weiter durch den Gebrauch des cytomegalovirus (CMV) unmittelbarer früher Befürworter vergrößert worden. Die Einschließung des Affe-Virus des Maurers-Pfizer (MPV)-CTE mit/ohne der Umdrehung hat Umschlag-Ausdruck vergrößert. Außerdem war die Konstruktion von CTE+REV bedeutsam mehr immunogenic dann CTE allein Vektor.

Zusätzliche Modifizierungen, um Ausdruck-Raten zu verbessern, haben die Einfügung von Erweiterer-Folgen, synthetischem introns, adenovirus Dreierführer (TPL) Folgen und Modifizierungen zum polyadenylation und transcriptional Beendigungsfolgen eingeschlossen. Ein Beispiel von DNA-Impfstoff plasmid ist pVAC, es verwendet SV40 Befürworter.

Impfeinsatz-Design

Immunogens kann zu verschiedenen Zellabteilungen ins Visier genommen werden, um Antikörper oder cytotoxic T-Zellantworten zu verbessern. Verborgen oder Plasma sind membranengebundene Antigene beim Verursachen von Antikörper-Antworten wirksamer als cytosolic Antigene, während cytotoxic T-Zellantworten durch das Zielen von Antigenen für die cytoplasmic Degradierung und den nachfolgenden Zugang in den Pfad der Klasse I des histocompatibility Hauptkomplexes (MHC) verbessert werden können. Das wird gewöhnlich durch die Hinzufügung des N-Terminals ubiquitin Signale vollbracht.

Die Angleichung des Proteins kann auch eine Wirkung auf Antikörper-Antworten, mit "bestellten" Strukturen (wie Virenpartikeln) haben wirksamer zu sein, als nicht eingeordnete Strukturen. Reihen von Minigenen (oder MHC Klasse I epitopes) von verschiedenem pathogens sind im Stande, cytotoxic T-Zellantworten auf mehrere pathogens besonders zu erheben, wenn ein TH epitope auch eingeschlossen wird.

Liefermethoden

DNA-Impfstoffe sind in Tiergewebe durch mehrere verschiedene Methoden eingeführt worden. Diese Liefermethoden werden in der Tabelle 2, mit den Vorteilen und Nachteilen der meistens verwendeten in der Tabelle 3 zusammengefassten Methoden kurz nachgeprüft.

Die zwei populärsten Annäherungen sind Einspritzung der DNA in der Salzquelle, mit einer Standardinjektionsnadel und Genpistole-Übergabe. Ein schematischer Umriss des Aufbaus eines DNA-Impfstoffs plasmid und seiner Nachlieferung durch diese zwei Methoden in einen Gastgeber wird am Wissenschaftlichen Amerikaner illustriert. Die Einspritzung in der Salzquelle wird normalerweise intramuskulär (IM) im Skelettmuskel, oder Haut-intra (Personalausweis) mit der DNA geführt, die an die extracellular Räume wird liefert. Dem kann durch electroporation geholfen werden; durch provisorisch zerstörende Muskelfasern mit myotoxins wie bupivacaine; oder durch das Verwenden hypertonischer Lösungen der Salzquelle oder des Rohrzuckers. Geschützte Antworten auf diese Methode der Übergabe können durch viele Faktoren, einschließlich Nadel-Typs, Nadel-Anordnung, Geschwindigkeit der Einspritzung, Volumens von Einspritzung, Muskeltyp, und Alter, physiologischer und Sexualbedingung des Tieres betroffen werden, das wird einspritzt.

Genpistole-Übergabe, die andere allgemein verwendete Methode der Übergabe, beschleunigt ballistisch plasmid DNA (pDNA), der auf Gold oder Wolfram-Mikropartikeln in die Zielzellen mit zusammengepresstem Helium als ein Beschleuniger adsorbiert worden ist.

Alternative Liefermethoden haben Aerosol-Eintröpfeln der nackten DNA auf Mucosal-Oberflächen, solcher als der Nasen- und die Lunge mucosa und die aktuelle Regierung von pDNA zum Auge und vaginalem mucosa eingeschlossen. Oberflächenübergabe von Mucosal ist auch mit cationic LIPOSOME-DNA-Vorbereitungen, biologisch abbaubare Mikrobereiche erreicht worden, hat Vektoren von Shigella oder Listeria für die mündliche Regierung zum Darmmucosa und recombinant adenovirus Vektoren verdünnt.

Die Methode der Übergabe bestimmt die Dosis der DNA, die erforderlich ist, eine wirksame geschützte Antwort zu erheben. Salzeinspritzungen verlangen variable Beträge der DNA von 10 μg-1 Mg, wohingegen Genpistole-Übergaben verlangen, dass 100 bis 1000mal weniger DNA als intramuskuläre Salzeinspritzung eine wirksame geschützte Antwort erhebt. Allgemein, 0.2 μg - 20 μg sind erforderlich, obwohl Mengen mindestens 16 ng berichtet worden sind. Diese Mengen ändern sich von Arten bis Arten mit Mäusen, zum Beispiel etwa 10mal weniger DNA verlangend, als Primate. Salzeinspritzungen verlangen mehr DNA, weil die DNA an die extracellular Räume des Zielgewebes geliefert wird (normalerweise Muskel), wo es physische Barrieren überwinden muss (wie der grundlegende lamina und die großen Beträge des Bindegewebes, um einige zu erwähnen), bevor es durch die Zellen aufgenommen wird, während Genpistole-Übergaben DNA direkt in die Zellen bombardieren, auf weniger "Verschwendung" hinauslaufend.

Eine andere Annäherung an die DNA-Impfung ist Ausdruck-Bibliotheksimmunisierung (ELI). Mit dieser Technik potenziell können alle Gene von einem pathogen auf einmal geliefert werden, der für pathogens nützlich sein kann, die schwierig sind zu verdünnen oder Kultur. ELI kann verwendet werden, um sich zu identifizieren, welches von den Genen des pathogen eine Schutzantwort veranlasst. Das ist mit Mycoplasma pulmonis, eine murine Lunge pathogen mit einem relativ kleinen Genom geprüft worden, und es wurde gefunden, dass sogar teilweise Ausdruck-Bibliotheken Schutz vor der nachfolgenden Herausforderung veranlassen können.

Geschützte Antwort durch DNA-Impfstoffe erhoben

Helfer-T-Zellantworten

DNA-Immunisierung ist im Stande, eine Reihe von T Antworten, einschließlich lymphoproliferation und der Generation einer Vielfalt von cytokine Profilen zu erheben. Ein Hauptvorteil von DNA-Impfstoffen ist die Bequemlichkeit, mit der sie manipuliert werden können, um den Typ der T-Zellhilfe zu einem TH1 oder TH2 Antwort zu beeinflussen. Jeder Typ der Antwort hat kennzeichnende Muster von lymphokine und chemokine Ausdruck, spezifischen Typen von immunoglobulins ausgedrückt, Muster des Lymphozyt-Schwarzhandels und Typen von angeborenen geschützten erzeugten Antworten.

Aufhebung von verschiedenen Typen der T-Zellhilfe

Der Typ der erhobenen T-Zellhilfe ist unter Einfluss der Methode der Übergabe und des Typs von immunogen ausgedrückt, sowie das Zielen von verschiedenen lymphoid Abteilungen. Allgemein neigen Salznadel-Einspritzungen (entweder IM oder Personalausweis) dazu, TH1 Antworten zu veranlassen, während Genpistole-Übergabe TH2 Antworten erhebt. Das ist für intrazelluläre und membranengebundene Plasmaantigene, aber nicht für verborgene Antigene wahr, die scheinen, TH2 Antworten unabhängig von der Methode der Übergabe zu erzeugen.

Allgemein ist der Typ der erhobenen T-Zellhilfe mit der Zeit stabil, und ändert sich wenn herausgefordert, oder nach nachfolgenden Immunisierungen nicht, die normalerweise den entgegengesetzten Typ der Antwort in einem naiven Tier erhoben hätten. Jedoch, Mor und al.. (1995) immunisierte und erhöhte Mäuse mit pDNA Verschlüsselung des circumsporozoite Proteins der Maus Malariaparasit Plasmodium yoelii (PyCSP) und gefunden, dass sich die TH2 anfängliche Antwort nach dem Aufladen zu einer TH1 Antwort geändert hat.

Mechanistische Basis für verschiedene Typen der T-Zellhilfe

Es wird nicht verstanden, wie diese verschiedenen Methoden der DNA-Immunisierung oder die Formen des ausgedrückten Antigens, verschiedene Profile der T-Zellhilfe erheben. Es wurde gedacht, dass die relativ großen Beträge der in der IM Einspritzung verwendeten DNA für die Induktion von TH1 Antworten verantwortlich waren. Jedoch haben Beweise keine Unterschiede im Typ TH wegen der Dosis gezeigt. Es ist verlangt worden, dass der Typ der erhobenen T-Zellhilfe durch den unterschiedenen Staat von Antigen-Präsentieren-Zellen bestimmt wird. Zellen von Dendritic können differenzieren, um IL-12 zu verbergen (der TH1 Zellentwicklung unterstützt) oder IL-4 (der TH2 Antworten unterstützt). durch die Nadel eingespritzter pDNA ist endocytosed in die dendritic Zelle, die dann stimuliert wird, um für TH1 cytokine Produktion zu unterscheiden, während die Genpistole die DNA direkt in die Zelle bombardiert, so TH1 Anregung umgehend.

Praktischer Gebrauch der polarisierten T-Zellhilfe

Diese Polarisation in der T-Zellhilfe ist im Beeinflussen allergischer Antworten und autogeschützter Krankheiten nützlich. In autogeschützten Krankheiten würde die Absicht sein, die selbstzerstörerische TH1 Antwort (mit seinem verbundenen cytotoxic T Zelltätigkeit) zu einer nichtzerstörenden TH2 Antwort auszuwechseln. Das ist in der Vorkrankheitszündung für den gewünschten Typ der Antwort in vorklinischen Modellen erfolgreich angewandt und in der Verschiebung der Antwort für eine bereits feststehende Krankheit etwas erfolgreich worden.

Cytotoxic T-Zellantworten

Einer der größten Vorteile von DNA-Impfstoffen ist, dass sie im Stande sind, cytotoxic T Lymphozyten (CTL) ohne die innewohnende mit lebenden Impfstoffen vereinigte Gefahr zu veranlassen. CTL Antworten können gegen immunodominant und immunorecessive CTL epitopes, sowie Subdominante CTL epitopes gewissermaßen erhoben werden, der scheint, natürliche Infektion nachzuahmen. Das kann sich erweisen, ein nützliches Werkzeug im Festsetzen CTL epitopes eines Antigens und ihrer Rolle in der Versorgung der Immunität zu sein.

Cytotoxic T-Zellen erkennen kleinen peptides (8-10 Aminosäuren) complexed zu MHC Molekülen der Klasse I (Restifo u. a. 1995). Diese peptides werden aus endogenen cytosolic Proteinen abgeleitet, die erniedrigt und an das werdende MHC Molekül der Klasse I innerhalb von endoplasmic reticulum (ER) geliefert werden. Das Zielen von Genprodukten direkt zum ER (durch die Hinzufügung einer Amino-Endeinfügungsfolge) sollte so CTL Antworten erhöhen. Das ist mit recombinant Kuhpocken-Viren erfolgreich demonstriert worden, die Grippe-Proteine ausdrücken, aber der Grundsatz sollte auf DNA-Impfstoffe auch anwendbar sein. Wie man auch gezeigt hat, ist das Zielen von Antigenen für die intrazelluläre Degradierung (und so Zugang in den MHC Pfad der Klasse I) durch die Hinzufügung von ubiquitin Signalfolgen oder Veränderung anderer Signalfolgen, bei der Erhöhung von CTL Antworten wirksam gewesen.

CTL Antworten können auch durch die Co-Impfung mit co-stimulatory Molekülen wie B7-1 oder B7-2 für DNA-Impfstoffe gegen Grippe nucleoprotein oder GM-CSF für DNA-Impfstoffe gegen das murine Sumpffieber-Modell P. yoelii erhöht werden. Wie man auch gezeigt hat, hat die Co-Impfung mit plasmids, der co-stimulatory Moleküle IL-12 und TCA3 verschlüsselt, CTL Tätigkeit gegen HIV 1 und Grippe nucleoprotein Antigene vergrößert.

Humoral (Antikörper) Antwort

Durch DNA-Impfungen entlockte Antikörper-Antworten sind unter Einfluss mehrerer Variablen einschließlich des Typs des verschlüsselten Antigens; Position des ausgedrückten Antigens (d. h. intrazellulär gegen den verborgenen); Zahl, Frequenz und Dosis von Immunisierungen; Seite und Methode der Antigen-Übergabe, um einige zu nennen.

Kinetik der Antikörper-Antwort

Antworten von Humoral nach einer einzelnen DNA-Einspritzung können sehr länger gelebt werden als nach einer einzelnen Einspritzung mit einem recombinant Protein. Antikörper-Antworten gegen das Umschlag-Protein der Leberentzündung B Virus (HBV) (HBsAg) sind seit bis zu 74 Wochen ohne Zunahme gestützt worden, während die lebenslängliche Wartung der Schutzantwort auf Grippe haemagglutinin in Mäusen nach der Genpistole-Übergabe demonstriert worden ist. Antikörper verbergende Zellen wandern zum Knochenmark und der Milz für die langfristige Antikörper-Produktion ab, und werden allgemein dort nach einem Jahr lokalisiert.

Vergleiche von Antikörper-Antworten, die durch natürliche (viren)-Infektion, Immunisierung mit dem recombinant Protein und Immunisierung mit pDNA erzeugt sind, werden in der Tabelle 4 zusammengefasst. Antikörper-Antworten VON DNA erheben sich viel langsamer als, wenn natürliche Infektion oder recombinant Protein-Immunisierung vorkommen. Man kann nicht weniger als 12 Wochen brauchen, um Spitze titres in Mäusen zu erreichen, obwohl das Aufladen die Rate der Antikörper-Produktion vergrößern kann. Diese langsame Antwort ist wahrscheinlich wegen der niedrigen Stufen des im Laufe mehrerer Wochen ausgedrückten Antigens, der sowohl primäre als auch sekundäre Phasen der Antikörper-Antwort unterstützt.

Zusätzlich sind die titres von spezifischen durch die DNA-Impfung erhobenen Antikörpern niedriger als diejenigen, die nach der Impfung mit einem recombinant Protein erhalten sind. Jedoch zeigt DNA Immunisierungsveranlasste Antikörper größere Sympathie zu heimischem epitopes als recombinant Protein-veranlasste Antikörper. Mit anderen Worten veranlasst DNA-Immunisierung eine qualitativ höhere Antwort. Antikörper kann danach gerade eine Impfung mit der DNA veranlasst werden, wohingegen recombinant Protein-Impfungen allgemein eine Zunahme verlangen. Wie erwähnt, vorher kann DNA-Immunisierung verwendet werden, um das TH Profil der geschützten Antwort, und so den Antikörper isotype zu beeinflussen, der entweder mit natürlicher Infektion oder mit recombinant Protein-Immunisierung nicht möglich ist. Durch die DNA erzeugte Antikörper-Antworten sind nicht nur in der Impfung, aber als ein Vorbereitungswerkzeug auch nützlich. Zum Beispiel kann polyclonal und monoclonal Antikörper für den Gebrauch als Reagenzien erzeugt werden.

Die mechanistische Basis für die DNA hat geschützte Antworten erhoben

DNA-Auffassungsvermögen-Mechanismus

Als DNA-Auffassungsvermögen und nachfolgender Ausdruck zuerst in vivo in Muskelzellen demonstriert wurden, wurde es gedacht, dass diese Zellen in dieser Fähigkeit wegen ihres umfassenden Netzes von T-tubules einzigartig waren. Mit der Elektronmikroskopie wurde es vorgeschlagen, dass DNA-Auffassungsvermögen durch caveolae (oder, non-clathrin angestrichene Gruben) erleichtert wurde. Jedoch hat nachfolgende Forschung offenbart, dass andere Zellen (wie keratinocytes, fibroblasts und epithelische Zellen von Langerhans) auch DNA verinnerlichen konnten. Dieses Phänomen ist nicht das Thema von viel Forschung gewesen, so ist der wirkliche Mechanismus des DNA-Auffassungsvermögens nicht bekannt.

Zwei Theorien sind zurzeit populär - der im vivo Auffassungsvermögen der DNA nichtspezifisch in einer Methode vorkommt, die phago- oder pinocytosis, oder durch spezifische Empfänger ähnlich ist. Diese könnten 30kDa Oberflächenempfänger oder macrophage Müllmann-Empfänger einschließen. 30kDa bindet Oberflächenempfänger sehr spezifisch zu 4500-bp genomic DNA-Bruchstücken (die dann verinnerlicht werden) und auf beruflichem APCs und T-Zellen gefunden wird. Müllmann-Empfänger von Macrophage binden zu einer Vielfalt von Makromolekülen einschließlich polyribonucleotides, und sind so auch Kandidaten für das DNA-Auffassungsvermögen. Empfänger hat vermittelt DNA-Auffassungsvermögen konnte durch die Anwesenheit von polyguanylate Folgen erleichtert werden. Die weitere Forschung in diesen Mechanismus könnte sinnlos scheinen, denkend, dass Genpistole-Liefersysteme, cationic liposome das Verpacken und die anderen Liefermethoden diese Zugang-Methode umgehen, aber das Verstehen davon könnte im Reduzieren von Kosten nützlich sein (z.B. durch das Reduzieren der Voraussetzung für cytofectins), der in der Nahrungsmitteltierindustrie wichtig sein wird.

Antigen-Präsentation durch Knochenmark-abgeleitete Zellen

Studien mit schimärischen Mäusen haben gezeigt, dass Antigen durch abgeleitete Zellen des Knochenmarks präsentiert wird, die dendritic Zellen, macrophages und spezialisierte B-Zellen genannt berufliche Antigen-Präsentieren-Zellen (APC) Iwasaki einschließen u. a. 1997). Nach der Genpistole-Impfung zur Haut, transfected Zellen von Langerhans wandern zum abfließenden Lymphe-Knoten ab, um Antigen zu präsentieren. Nachdem, wie man auch gefunden hat, IM und ID-Einspritzungen, dendritic Zellen Antigen im abfließenden Lymphe-Knoten präsentiert haben und transfected macrophages im peripherischen Blut gefunden worden sind.

Außer direktem transfection von dendritic Zellen oder macrophages, wie man auch bekannt, kommt böse Zündung im Anschluss an IM, Personalausweis und Genpistole-Übergaben der DNA vor. Böse Zündung kommt vor, wenn eine Knochenmark-abgeleitete Zelle peptides von Proteinen präsentiert, die in einer anderen Zelle im Zusammenhang der MHC Klasse 1 aufgebaut sind. Das kann cytotoxic HauptT-Zellantworten und scheinen, für eine volle primäre geschützte Antwort wichtig zu sein.

Rolle der Zielseite

IM und ID-Übergabe der DNA beginnen geschützte Antworten verschieden. In der Haut nehmen keratinocytes, fibroblasts und den Zellen von Langerhans auf und drücken Antigen aus, und sind dafür verantwortlich, eine primäre Antikörper-Antwort zu veranlassen. Zellen von Transfected Langerhans wandern aus der Haut (innerhalb von 12 Stunden) zum abfließenden Lymphe-Knoten wo sie sekundäre HauptB- und T-Zellantworten ab. Im Skelettmuskel, andererseits, sind gestreifte Muskelzellen am häufigsten transfected, aber scheinen, im Besteigen einer geschützten Antwort unwichtig zu sein. Statt dessen "wäscht" "sich" eingeimpfte DNA von IM in den abfließenden Lymphe-Knoten innerhalb von Minuten, wo distal dendritic Zellen transfected sind und dann eine geschützte Antwort beginnen. Transfected myocytes scheinen, als ein "Reservoir" des Antigens für den Schwarzhandel-Fachmann APCs zu handeln.

Wartung der geschützten Antwort

DNA-Impfung erzeugt ein wirksames geschütztes Gedächtnis über die Anzeige von Komplexen des Antigen-Antikörpers auf follicular dendritic Zellen (FDC), die starke B-Zellanreger sind. T-Zellen können vom ähnlichen Keimzentrum dendritic Zellen stimuliert werden. FDC sind im Stande, ein geschütztes Gedächtnis zu erzeugen, weil Antikörper-Produktion auf langfristigen Ausdruck des Antigens "übergreift", Antigen-Antikörper immunocomplexes erlaubend, sich zu formen und durch FDC gezeigt zu werden.

Interferon

Sowohl Helfer als auch cytotoxic T-Zellen können Vireninfektionen kontrollieren, indem sie Interferon verbergen. Cytotoxic T Zellen töten gewöhnlich Viren-angesteckte Zellen. Jedoch können sie auch stimuliert werden, um Antivirencytokines wie INF-γ und TNF-α zu verbergen, die die Zelle nicht töten, aber strenge Beschränkungen auf Vireninfektion durch den unten regelnden der Ausdruck von Virenbestandteilen legen. DNA-Impfungen können so verwendet werden, um Vireninfektionen durch die nichtzerstörende IFN-vermittelte Kontrolle zu zügeln. Das ist für die Leberentzündung B Virus demonstriert worden. IFN-γ ist auch im Steuern von Sumpffieber-Infektionen kritisch wichtig und sollte in Betracht gezogen werden, wenn er Antimalaria-DNA-Impfstoffe entwickelt.

Modulation der geschützten Antwort

Modulation von Cytokine

Für einen Impfstoff, um wirksam zu sein, muss es eine passende geschützte Antwort für einen gegebenen pathogen veranlassen, und die Fähigkeit von DNA-Impfstoffen, T-Zellhilfe zu TH1 oder TH2 Profilen zu polarisieren, und CTL und/oder Antikörper nach Bedarf zu erzeugen, ist ein großer Vorteil in dieser Beziehung. Das kann durch Modifizierungen zur Form des Antigens ausgedrückt (d. h. intrazellulär gegen den verborgenen), die Methode und der Weg der Übergabe und die Dosis der gelieferten DNA vollbracht werden. Jedoch kann es auch von der Co-Regierung der plasmid DNA vollbracht werden, die geschützte Durchführungsmoleküle, d. h. cytokines, lymphokines oder co-stimulatory Moleküle verschlüsselt. Diese "genetischen adjuvants" können mehrere Wege verwaltet werden:

• als eine Mischung von 2 getrennten plasmids, eine Verschlüsselung des immunogen und die andere Verschlüsselung des cytokine;
• als ein einzelner bi- oder polycistronic Vektor, der durch Distanzscheibe-Gebiete getrennt ist; oder
• als eine plasmid-verschlüsselte Chimäre oder Fusionsprotein.

Im Allgemeinen vergrößert die Co-Regierung von pro-entzündlichen Agenten (wie verschiedener interleukins, Geschwulst-Nekrose-Faktor und GM-CSF) plus TH2, der cytokines veranlasst, Antikörper-Antworten, wohingegen pro-entzündliche Agenten und TH1, der cytokines veranlasst, humoral Antworten vermindern und cytotoxic Antworten vergrößern (der im Virenschutz, zum Beispiel wichtiger ist). Moleküle von Co-Stimulatory wie B7-1, B7-2 und CD40L werden auch manchmal verwendet.

Dieses Konzept ist in der aktuellen Regierung von pDNA erfolgreich angewandt worden, der IL-10 verschlüsselt. Plasmid, der B7-1 (ein ligand auf APCs) verschlüsselt, hat die geschützte Antwort in Antitumor-Modellen erfolgreich erhöht, und sich plasmids vermischend, GM-CSF verschlüsselnd, und das circumsporozoite Protein von P. yoelii hat (PyCSP) Schutz gegen die nachfolgende Herausforderung erhöht (wohingegen plasmid-verschlüsselter PyCSP allein getan hat nicht). Es wurde vorgeschlagen, dass GM-CSF dendritic Zellen veranlassen kann, Antigen effizienter zu präsentieren, und IL-2 Produktion und TH Zellaktivierung zu erhöhen, so die vergrößerte geschützte Antwort steuernd. Das kann weiter durch die erste Zündung mit einem pPyCSP und pGM-CSF Mischung und dem späteren Aufladen mit einem recombinant poxvirus das Ausdrücken von PyCSP erhöht werden. Jedoch, Co-Einspritzung von plasmids, der GM-CSF (oder IFN-γ oder IL-2) und ein Fusionsprotein von P verschlüsselt. chabaudi merozoite Oberflächenprotein 1 (C-Endstation) - Leberentzündung B Virus-Oberflächenprotein (PcMSP1-HBs) hat wirklich Schutz gegen die Herausforderung im Vergleich zum Schutz abgeschafft, der durch die Übergabe von pPcMSP1-HBs erworben ist, allein.

Die Vorteile, genetischen adjuvants zu verwenden, sind ihre niedrigen Kosten und Einfachheit der Regierung, sowie Aufhebung von nicht stabilem recombinant cytokines und potenziell toxischem, "herkömmlichem" adjuvants (wie Alaun, Kalzium-Phosphat, monophosphoryl lipid A, Cholera-Toxin, cationic und mannan-gekleideter liposomes, QS21, carboxymethylcellulose und ubenimix). Jedoch ist die potenzielle Giftigkeit des anhaltenden cytokine Ausdrucks, und in vielen gewerblich wichtigen Tierarten nicht gegründet worden, cytokine Gene muss noch identifiziert und isoliert werden. Außerdem stimmen verschlüsselte cytokines des verschiedenen plasmid das Immunsystem verschieden gemäß der Lieferzeit ab. Zum Beispiel werden einige cytokine plasmid DNA am besten nach dem immunogen pDNA geliefert, weil prä- oder Co-Übergabe wirklich spezifische Antworten vermindern, und nichtspezifische Antworten vergrößern kann.

Immunostimulatory Motive von CpG

Plasmid DNA selbst scheint, eine adjuvant Wirkung auf das Immunsystem zu haben. Wie man gefunden hat, hat bakteriell abgeleitete DNA angeborene geschützte Abwehrmechanismen, die Aktivierung von dendritic Zellen und die Produktion von TH1 cytokines ausgelöst. Das ist wegen der Anerkennung von bestimmtem CpG dinucleotide Folgen, die immunostimulatory sind. CpG stimulatory (CpG-S) Folgen kommen zwanzigmal öfter in der bakteriell abgeleiteten DNA vor als in eukaryotes. Das ist, weil eukaryotes "Unterdrückung von CpG" ausstellen - d. h. CpG dinucleotide Paare kommen viel weniger oft vor als erwartet. Zusätzlich sind CpG-S Folgen hypomethylated. Das kommt oft in der Bakterien-DNA vor, während Motive von CpG, die in eukaryotes vorkommen, der ganze methylated am cytosine nucleotide sind. Im Gegensatz, nucleotide Folgen, die die Aktivierung einer geschützten Antwort hemmen (hat das Neutralisieren von CpG oder CpG-N genannt), sind über den vertretenen in eukaryotic Genomen. Wie man gefunden hat, ist die optimale immunostimulatory Folge unmethylated CpG dinucleotide flankiert durch zwei 5' purines und zwei 3' pyrimidines gewesen. Zusätzlich Gebiete außerhalb dieses immunostimulatory flankierend, muss hexamer guanine-reich sein, um Schwergängigkeit und Auffassungsvermögen in Zielzellen zu sichern.

Das angeborene System arbeitet synergistisch mit dem anpassungsfähigen Immunsystem, um zu besteigen, dass eine Antwort gegen die DNA Protein verschlüsselt hat. CpG-S Folgen veranlassen polyclonal B-Zellaktivierung und den upregulation des cytokine Ausdrucks und der Sekretion. Stimulierte macrophages verbergen IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-β und IFN-γ, während stimulierte B-Zellen IL-6 und einen IL-12 verbergen.

Die Manipulation von CpG-S und CpG-N Folgen im plasmid Rückgrat von DNA-Impfstoffen kann den Erfolg der geschützten Antwort auf das verschlüsselte Antigen sichern, und die geschützte Antwort zu einem TH1 Phänotyp steuern. Das ist nützlich, wenn ein pathogen eine TH Antwort für den Schutz verlangt. CpG-S Folgen sind auch als äußerlicher adjuvants sowohl für die DNA als auch für recombinant Protein-Impfung mit variablen Erfolg-Raten verwendet worden. Andere Organismen mit hypomethylated Motiven von CpG haben auch die Anregung der polyclonal B-Zellvergrößerung demonstriert. Jedoch kann der Mechanismus dahinter mehr kompliziert sein, als, wie man gefunden hat, einfacher methylation - hypomethylated murine DNA keine geschützte Antwort bestiegen hat.

Die meisten Beweise für die Existenz von immunostimulatory Folgen von CpG kommen aus Murine-Studien. Klar kann die Extrapolation davon Daten zu anderen Arten sollten mit der Verwarnung - verschiedene Arten getan werden, verschiedene angrenzende Folgen verlangen, weil sich die verbindliche Genauigkeit von Müllmann-Empfängern zwischen Arten unterscheidet. Zusätzlich können Arten wie ruminants gegen immunostimulatory Folgen wegen der großen Gastrointestinal-Last unempfindlich sein, die sie ausstellen. Weitere Forschung kann in der Optimierung der DNA-Impfung besonders in der Nahrungsmitteltierindustrie nützlich sein.

Alternative Zunahmen

DNA-PRIMED geschützte Antworten kann von der Regierung des recombinant Proteins oder recombinant poxviruses erhöht werden. "Hauptzunahme"-Strategien mit dem recombinant Protein haben sowohl Neutralisieren-Antikörper titre, als auch Antikörper-Begierde und Fortsetzung, für schwachen immunogens, wie HIV 1 Umschlag-Protein erfolgreich vergrößert. Wie man gezeigt hat, sind Virus-Zunahmen von Recombinant beim Aufladen der DNA-PRIMED CTL Antworten sehr effizient gewesen. Die Zündung mit der DNA stellt die geschützte Antwort auf den erforderlichen immunogen ein, während das Aufladen mit dem recombinant Virus einen größeren Betrag des ausgedrückten Antigens zur Verfügung stellt, zu einer großen Zunahme in spezifischen CTL Antworten führend.

Hauptzunahme-Strategien sind im Verursachen des Schutzes gegen die Malariaherausforderung in mehreren Studien erfolgreich gewesen. Mäuse von Primed mit dem plasmid Plasmodium yoelii Circumsporozoite OberflächenDNA-Verschlüsselungsprotein (PyCSP), das dann mit einem recombinant Kuhpocken-Virus erhöht ist, das dasselbe Protein ausdrückt, hatten bedeutsam höhere Niveaus von Antikörper, CTL Tätigkeit und IFN-γ, und folglich höheren Niveaus des Schutzes als Mäuse, die immunisiert und mit der plasmid DNA erhöht sind, allein. Das kann weiter durch die Zündung mit einer Mischung von plasmids Verschlüsselung von PyCSP und murine GM-CSF vor dem Aufladen mit recombinant Kuhpocken-Virus erhöht werden. Eine wirksame Hauptzunahme-Strategie für das affenartige Malariamodell P. knowlesi ist auch demonstriert worden. Rhesusaffen waren primed mit einem Mehrteil-, Mehrstufen-DNA-Impfstoff, der zwei mit der Leber stufige Antigene - das Circumsporozoite-Oberflächenprotein (PkCSP) und Sporozoite-Oberflächenprotein 2 (PkSSP2) - und zwei Blutbühne-Antigene - das Spitzenmerozoite-Oberflächenprotein 1 (PkAMA1) und Merozoite-Oberflächenprotein 1 (PkMSP1p42) verschlüsselt. Sie wurden dann mit einem recombinant canarypox Virus erhöht, das alle vier Antigene (ALVAC-4) verschlüsselt. Immunisierte Affen haben Antikörper gegen sporozoites entwickelt und haben erythrocytes und IFN \U 03B3\absondernde T-Zellantworten gegen peptides von PkCSP angesteckt. Der teilweise Schutz gegen die Sporozoite-Herausforderung wurde erreicht, und bösartiger parasitemia wurde im Vergleich zu Kontrollaffen bedeutsam reduziert. Diese Modelle, während nicht ideal für die Extrapolation zu P. falciparum in Menschen, werden in vorklinischen Proben wichtig sein.

Zusätzliche Methoden, geschützte Antworten VON DNA zu erhöhen

Formulierungen der DNA

Die Leistungsfähigkeit der DNA-Immunisierung kann durch das Stabilisieren der DNA gegen die Degradierung und die Erhöhung der Leistungsfähigkeit der Übergabe der DNA in Antigen-Präsentieren-Zellen verbessert werden. Das ist durch den Überzug biologisch abbaubare cationic Mikropartikeln (wie poly (lactide-co-glycolide) formuliert mit dem cetyltrimethylammonium Bromid) mit der DNA demonstriert worden. Solche DNA-GEKLEIDETEN Mikropartikeln können so bei der Aufhebung von CTL wirksam sein wie recombinant Kuhpocken-Viren, besonders wenn gemischt, mit dem Alaun. Partikeln 300 nm scheinen im Durchmesser, für das Auffassungsvermögen durch Antigen-Präsentieren-Zellen am effizientesten zu sein.

Vektoren von Alphavirus

Recombinant mit Sitz in alphavirus Vektoren sind auch verwendet worden, um DNA-Impfungsleistungsfähigkeit zu verbessern. Das Gen, das das Antigen von Interesse verschlüsselt, wird in den alphavirus replicon eingefügt, Strukturgene ersetzend, aber replicase Nichtstrukturgene intakt verlassend. Das Sindbis Virus und Semliki Waldvirus sind verwendet worden, um recombinant alphavirus replicons zu bauen. Verschieden von herkömmlichen DNA-Impfungen, jedoch, alphavirus Vektoren töten transfected Zellen, und werden nur vergänglich ausgedrückt. Außerdem werden alphavirus replicase Gene zusätzlich zum Impfeinsatz ausgedrückt. Es ist nicht klar, wie alphavirus replicons eine geschützte Antwort erheben, aber es wird gedacht, dass das wegen der hohen Niveaus des Proteins sein kann, das durch diesen Vektoren, replicon-veranlasste cytokine Antworten oder das replicon-veranlasste Apoptosis-Führen zu erhöhtem Antigen-Auffassungsvermögen durch dendritic Zellen ausgedrückt ist.

Siehe auch

• Vektor-DNA
• HIV-Impfstoff

Links

• PowderMed pdf melden
• DyNAVacS, ein einheitliches Werkzeug für das optimierte DNA-Impfdesign vom Institut für Genomics und Integrative Biology.